宝马娱乐在线:当前非洲猪瘟疫苗研发进展如何?

1、prrs 活疫苗具有较强的持续传播能力

猪传染性胃肠炎引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病。tge首次由doyle和hut…
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猪传染性胃肠炎引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病。tge首次由doyle和hutchingsl946年在美国报道,日本先后报道该病,这之后欧洲、北美、亚洲等多个国家相继报道发生了tge,现已成为一种世界性猪的疾病。我国从60年代起就有tge的报道,近些年来有进一步流行的趋势,尤其是冬季和早春寒冷季节常呈地方性暴发流行,给养猪业造成极大危害。在1984年和1986年间,欧洲北美等地又报道了一种特别的tgev自然缺失变异株-猪呼吸道冠状病毒(porcine
respiratory
coronavirus,prcv),我国目前仍未见有该病毒的报道。tgev仍是现今引起仔猪发病和死亡的主要原因之一。1992年美国猪场tge血清阳性率为36%,大多欧洲国家猪场阳性率几乎为100%,我国台湾地区1993年仔猪tge的阳性率高达65%。本文就tgev研究进展作一综述。
1 形态学特征
tgev属于冠状病毒属,是一种多形性有囊膜的病毒。病毒粒子呈圆形或椭圆形,直径约为90-160
nm,外膜上覆有花瓣状纤突,纤突长而稀疏,末端呈球状,直径10nm左右。某些病毒粒子在以磷钨酸负染后,可见到一个电子透明中心或没有特征的核心,其内部具有一个呈串珠样的丝状物。
2 理化学特性
tgev在冻存状态下很稳定,肠组织内病毒在-20℃
下保存6~18个月滴度无明显下降,但病毒不耐热,加热65℃ 10 min或56c45
min即全部灭活。粪尿中病毒粒子在5℃下存放8周、20℃下2周和35
℃下24h仍具有感染性。病毒在光、紫外线照射下迅速灭活,对乙醚、氯仿和去氧胆酸钠敏感,而在胆汁中相当稳定。用0.05%甲醛溶液37℃处理20
min即能使病毒灭活。tgev在ph4~8时稳定,对胰酶有抵抗力,能耐0.5%胰蛋白酶1
h,但强、弱毒株对胰酶和蛋白分解酶的敏感性不同,毒株的毒力越弱,其对胰酶的敏感性越高。tgev的这些特性有利于自身抵抗胃肠的酸碱环境。至今仍未阐明各种化学、物理的处理对tgev敏感性、毒力影响的直接关系。
3 生物学特性
tgev和prcv野毒株对细胞培养的适应情况不一,较敏感的细胞是猪甲状腺细胞、唾液腺细胞、猪睾丸细胞和胎猪肾细胞,此外也可用食管、小肠组织块等分离病毒。近年来,st、pkl5细胞系成为实验室培养tegv和prcv易感并方便的细胞培养基。tgev感染细胞后4~5
h,就可在细胞中用免疫荧光试验检测到病毒抗原,病毒通过内质网的出芽形式成熟,成熟病毒从感染细胞逸出被覆在宿主细胞膜表面。tgev主要侵染小肠绒毛上皮细胞并增殖,引起绒毛显着萎缩,导致病猪发生严重腹泻。prcv主要侵染呼吸道上皮细胞和肺组织,在小肠上皮细胞中只能零星局部感染,不引起腹泻,不产生或仅产生轻微的呼吸道症状,但感染了prcv的猪如继发感染了细菌或其他病毒则会引起呼吸道疾病,甚至引起病猪突然死亡。
4 基因组成、结构与功能
tgev与prcv含有一大的聚腺苷酸化的单链正股rna基因组,病毒基因组的复制和表达与其他冠状病毒相似。tgev的基因组全长约28~30kb左右,分子量为9x106kda,在其5‘端有一帽结构。3’端有一共价结合的polya结构。tgev的5‘端约20
kb的序列编码rna依赖的rna聚合酶,在3’端约8.4
kb序列含8个开放读码框架,编码亚墓因组rna表达的全部mrna基因组。所有mrna都具有相同的3’polya末端,5‘末端则长短不一。除了mrna8之外,所有mrna都是多顺反子结构,但只有在5’末端的单一序列才具有编码功能。
4.1 pol 酶
冠状病毒的5‘端不翻译区域被认为是编码rna依赖的rna聚合酶。在tgevpurdue-115株的5’端约20
kb的序列中含有2个大的开放读码框架orfla和orflb,分别含有4 017和2
698个密码子。在orfla的上游有一个长3个密码子的小orf,冠状病毒属的传染性支气管炎病毒和人冠状病毒hcv229e的同源小orf则分别长8个和11个密码子。在tgev的orfla和orflb各自翻译产物中均含有一个核糖体移码激活区。tgevorfla的氨基端较羧基端表现出更大的序列差异性,tgevorflb较保守。
4.2 mrna基因组
tgev进入感染细胞后,由先导rna引物起始转录合成,正链rna先转录出一条负链rna。先导rna序列从负链模板上独立转录下来,然后与负链模板上各基因起始处的同源亚基因序列配对,引导mrna的合成。mrna的合成是不连续的,尚未合成完毕的mrna可从模板上脱落下来形成游离的mrna中间体,这些中间体又可重新接合到模板上继续合成。tgev整个先导序列长约90个核苷酸。在大多mrnaorf的上游存在先导rna引物识别序列actaaac,但mrna4的识别序列为ctaaac,缺少一个a,这被认为是导致mrna4较小的原因。
4.2.1 s基因
tgev s基因编码的s蛋白全长为1 447-1
449个氨基酸左右,内含有32~34个n-联糖基化位点。s蛋白的n-联糖基化位点的变异主要集中在氨基端区域。s蛋白的4个主要抗原位点也存在于氨基端区域。a位点主要诱导中和抗体的产生,可分成aa、ab、ac
3部分,核心分别存在于538、591和543等3个残基处,a位点在s蛋白中保守存在。其他3个位点,b存在于97-144残基区,c位点存在于49-52残基区,d位点存在于382-385残基区,b、c、d三位点均不保守。a、b两位点是依赖于s蛋白的糖基化作用和正确折叠构型产生的,而c、d两位点的这种依赖性则很小。比较prcv的基因组发现,在等位于tgev的s基因起始密码子下游59核苷酸处,存在672个核苷酸的缺失,编码21-245氨基酸残基缺失,不存在‘b、c、d
3个抗原位点。prcv在s基因处的缺失机制仍不清楚,但聚合酶作用下的rna重组可能是原因之一,有人推测tgev疫苗免疫的压力也起了重要作用。
4.2.2 mrna3
tgev的mrna3含2个orf:orf3a和orf3b,分别编码2个非结构蛋白。内含有n-联糖基化位点。orf3a区的点突变、缺失和插入造成了tgev不同毒株在此区的变异较大,orf3b较保守。mrna3区域与tgev的病原性或毒力强弱密切相关。比较tgev和prcv的mrna3,发现等位于tgev
orf3a的起始密码子处,prcv缺失了22个碱基,在orf3a的225碱基处,prcv缺失了13个碱基,没有acta序列,从而先导rna引物识别序列actaaac缺失,导致prcv在orf3a区缺失。在等位于tgev
orf3b处,tgev的3个t被prcv的2个a和一个c替换,prcv在此形成了一个新的先导rna引物认识序列aactaaac,从而使得prcv在mrna3亚基因处出现一个orf。tgev还有一种小蚀斑表型改变变异株,其s基因与野毒型tgev
s基因相似,但sp病毒s基因下游却出现一大的缺失,这一缺失导致一潜在病毒编码蛋白的orf丧失,并使第二个潜在病毒蛋白的n端部分丧失。这两个orfs在高代次细胞传代的nouzilly株也不存在。因此有人认为sp病毒、nouzilly株和prcv株的病原性或毒力改变与这些基因缺失和替换有关。
4.2.3 orf4、m、n、orf7
tgev的这些区域高度保守,未发现prcv同tgev有很大差异,同源性高达98%。orf4编码82个氨基酸长的膜相关蛋白,此区域不是病毒增殖的必需区,它的表达可能与病毒粒子的病原性或毒力有关。orf7编码78个氨基酸。
5 主要结构蛋白及功能
5.1 s蛋白 该蛋白位于病毒的最外面,构成病毒的纤突,分子量200
kda左右。s蛋白氨基端是tgev识别靶细胞、诱导产生中和抗体和决定病毒组织嗜性的密切相关区。其中219残基区与病毒粒子对肠道的组织嗜性至关重要。不同毒株氨基端变异较大。s蛋白羧基端构成纤突的柄及跨膜区,高度保守。在tgevs蛋白的n端区域存在一血凝活性区,用唾液酸酶处理tgev可激发血凝活性,但此区域在prcv
s蛋白中缺失,因此检测血凝活性的存在与否是一种区分prcv和tgev的方法。
5.2 m蛋白
m蛋白长约262个氨基酸,分子量28-31kda。m蛋白的羧基端暴露在病毒粒子的表面,是病毒的免疫显性区,针对此区域的抗体可以中和tgev和介导tgev感染的细胞发生补体溶解反应。m蛋白氨基端6-22残基区存在一干扰素基因决定簇,可在体内外诱导。-干扰素的产生。
5.3 n蛋白
是病毒粒子内部的一种蛋白,由382个氨基酸组成,分子量47kda,主要构成病毒的核蛋白。n蛋白具有3个抗原区域,这3个抗原区域在tgev分离株中均高度保守,但prcv在b区域与tgev有差异。n蛋白含有蛋白水解位点,通过蛋白水解作用和去磷酸化作用,对病毒粒子的装配起重要影响。
6 与相关冠状病毒抗原性、基因组之间关系
通过血清学方法可将冠状病毒分为3个抗原组,其中tgev与prcv、犬冠状病毒、猫肠道冠状病毒、人冠状病毒的抗原性之间存在相关性。tgev和相关冠状病毒均含有3种基因相似结构蛋白:s蛋白、n蛋白和m蛋白。此外,tegv坯含有另一种结构蛋白sm,而其他一些冠状病毒则含有另一种结构蛋白he,gp65通过二硫键形成二聚体,这种二聚体在s蛋白纤突下形成第2个冠,gp65具有血凝活性。冠状病毒s蛋白是否可裂解成两部分是冠状病毒分类的另一特征。tgev和相关冠状病毒的s蛋白不能分裂,而火鸡冠状病毒、hcv、oc43、bcv、mhv、ibv及hev等在纤突蛋白上存在一蛋白分裂位点,可使s蛋白分裂为s1和s2两种蛋白。而根据核酸序列数据可将tgev、prcv、ccv、fipv、fecv、pedv和hcv229e分为一组。
7 免疫原性
s蛋白是tgev的主要抗原蛋白,其受体是b细胞,可介导引起体液免疫应答。tgev还是一种细胞依赖性的病毒抗原,t细胞可对整个病毒粒子产生应答反应,引起细胞免疫应答。prcv与tgev的病原性,组织嗜性不同,但抗原关系密切。用prcv制成的活苗免疫孕母猪可引起较高水平的igg,但iga和igm的水平不高。有人认为这是因为prcv主要在呼吸道组织中增殖,而呼吸道的淋巴小结较肠道内淋巴小结少很多,故抗原刺激呼吸道产生的淋巴母细胞少,从而使得局部产生的iga少。看来,prcv可提供抗tgev的部分保护力。
8 病原性
8.1 组织嗜性和宿主细胞
tgev主要是一种肠道病原体,但也可以在呼吸道中增殖。对tgev分离株进行连续细胞传代可使病毒丧失对肠道的组织嗜性,但仍对呼吸道组织和肺泡巨噬细胞保持嗜性。高度致弱的tgev可在上呼吸道中增殖,包括扁桃体和肺,但不能在新生仔猪肠道中增殖。尽管tgev通常引起急性肠道疾病,但也可持续感染,此时从肠道中一般检测不到病毒,相反能从感染后100天的康复猪的呼吸道中检测到病毒。
8.2 病毒受体 tgev的受体是细胞表面的氨肽酶n和200
kda的蛋白分子。小肠上皮细胞、成纤维细胞刷状缘和肺等均可表达丰富的papn,小肠分泌的papn对多肽的消化起重要作用。3日龄以内的仔猪绒毛上覆盖着上皮细胞分泌的papn,而另一受体200
kda的蛋白分子在微绒毛的顶端大量存在,在绒毛上皮细胞中则含量很少,这被认为是tgev对新生仔猪敏感的原因之一。初乳、乳汁内的因子可以影响200kda的蛋白分子或papn的表达,同时可干扰病毒与受体的结合,这是喂初乳的仔猪比不喂初乳的仔猪更易耐受tgev的感染,感染率和死亡率下降的原因。
8.3 年龄因素
tgev病原性与感染猪的年龄关系密切相关,病毒感染成年猪的剂量比感染新生仔猪剂量要高10倍。
8.4 传播宿主
育肥猪和哺乳母猪是tgev的重要传染源,可通过污染了的粪便、哺乳母猪的乳汁、饲料以及工作人员的鞋子、衣物等传染给仔猪。此外,猫、狗、狐、苍蝇、鸟也可能是tgev的传染源。
8.5 腹泻的发生机制
经口或鼻感染的病毒,经吞咽到达猪的小肠后,在肠绒毛上皮细胞上增殖,从而造成黏膜物理性屏障和酶活性降低,出现电解质失衡和营养成分的分解吸收异常,导致肠管内的渗透压增高,进而出现脱水和腹泻;特别是损害小肠黏膜上皮,导致产生乳糖酶等酶类的机能受阻,妨碍了糖类的分解吸收;另外由于小肠绒毛萎缩,使肠隐窝细胞代偿性增生,分泌作用增强,以及肠管内的异常发酵等,这些都是造成腹泻和病情恶化的原因。

1 PRRSV的生物学特性

传染病流行的三个基本环节是:传染源、传播途径和易感动物。我们现在能做的就是控制传染源和切断传播途径,易感动物暂无有效疫苗保护,且近期也不会有有效的疫苗出现。

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3 PRRSV的新型疫苗研究

宝马娱乐在线:当前非洲猪瘟疫苗研发进展如何?。Argilaguet等将P30和P54基因与猪白细胞抗原II的特异性抗体单链可变区在真核表达载体中融合表达;接种该疫苗后,能够使部分动物获得一定的免疫保护效果。

传统蓝耳病弱毒疫苗安全性的问题

1998年,Meulenberg等获得了PRRSV欧洲型代表株­LV株的感染性cDNA克隆。2003年,美洲型代表株(VR­2332)的感染性克隆也宣告成功[17],这是PRRSV
研究过程中的又一重大进展。借助反向遗传学操作技术对PRRSV主要进行以下几方面的研究。

采用天然致弱ASFV毒株免疫动物能够产生较好的针对同源强毒株的攻毒保护,保护率在66%~100%之间。

→减少或不用蓝耳病弱毒活疫苗

PRRSV的分子生物学研究虽然取得了很大的进展,但人们对该病毒的致病机理、持续感染机制、免疫机制及一些病毒编码蛋白的结构与功能关系尚不十分清楚。如何阐明这些机理将是今后对PRRSV
的重点研究方向,随着对PRRSV分子生物学研究的不断深入,这些问题将逐渐得到解决,借此人们将研究出更加有效的预防和控制PRRS的措施。

随着全基因测序技术的不断成熟以及ASFV基因功能的不断探索,通过基因敲除毒力基因或者免疫抑制基因的方式制备ASF弱毒疫苗的可能性越来越大。

1、prrsv的基因结构及编码蛋白

6 展望

1、ASF灭活疫苗免疫后可产生高效价的抗体,但很难检测到中和抗体的存在;

prrsv 感染与机体的免疫抑制

ORF6编码膜基质蛋白又称M蛋白,分子质量为19
ku。M蛋白能刺激T淋巴细胞的增生,诱导产生的抗体具有中和作用。M蛋白是PRRSV中最保守的蛋白,欧、美型毒株间M蛋白氨基酸序列同源性在78%~81%,而同型毒株M蛋白氨基酸的同源性大于96%。M蛋白可能在维持病毒形态、病毒组装和出芽中发挥作用。

传代过程中,ASFV致病力逐渐下降,同时病毒免疫原性和稳定性也随之下降。在葡萄牙和西班牙进行的田间试验,特别是在葡萄牙,550,000只猪免疫后有128,684只出现严重的免疫副反应,肺炎、运动障碍、皮肤溃疡、流产甚至死亡,同时出现大量病毒携带猪。而且随后出现的ASF疫情中分离的弱毒株也很有可能来自此次疫苗接种。

3、 prrs 活疫苗免疫可导致临床发病

关键词:猪繁殖与呼吸综合征病毒;新型疫苗;反向遗传技术;分子诊断

小结:单纯依靠一个或几个病毒基因表达的蛋白很难达到免疫预防效果。

n 蛋白在感染细胞中大量表达,约占病毒粒子蛋白总量的 20%~40%。n
蛋白免疫原性极强,最少含有 4 个抗原决定簇,其中 a、c
区抗原决定簇在欧洲型毒株比较保守,b
区抗原决定簇在欧洲和北美洲两型毒株都比较保守,d
区抗原决定簇在两型毒株中都不保守。有无论由于自然感染或人工感染的猪均可以产生较高水平的抗
n 蛋白的抗体,因此具有很好的诊断学意义。

建立有效实用的诊断技术是防控PRRS流行的重要环节,目前,对PRRSV的分子生物学诊断技术主要是RT­PCR,它是一种良好的可替代细胞培养检测PRRSV的方法,Suarez等初步建立了RT­PCR技术并应用到疾病检测中。Christopher等建立了检测猪精液中PRRSV的RT­PCR方法,该方法快速、敏感、可靠,试验接毒92
d后,仍可从猪的精液中检测出病毒RNA。Kono等用套式RT­PCR,即设计一对共同引物和两对特异性引物,提取病毒RNA后,先用共同引物进行RT­PCR扩增,再分别用两对特异性引物进行PCR,结果显示比常规PCR在敏感性上提高了100倍。Inoue
R等[23]将FTA(Flinders technology associates filter
papers)卡与实时定量PCR技术相结合应用于检测猪血病毒,该法不需提取病毒RAN即可进行PCR,缩短了时间,简化了操作程序。Egli
C等[24]建立了定量TaqMan
RT­PCR方法来检测PRRSV,通过与其他检测方法比较,发现在可操作性、敏感性及特异性上都具有一定的优越性,而且能区分不同的毒株。但该法需要合成特定的探针,价格昂贵。Martínez
E 等[25]建立了SYBR Green
荧光定量PCR,样品病毒含量少至0.03TCID50仍可检测出,试验接毒2
d后从猪血清中即可检测到病毒,具有很高的敏感性,另外,该法还能对欧洲株和美洲株进行分型。与荧光探针法(TaqMan)相比,荧光染料SYBR
Green法价格更便宜,适用于大量临床样品的检测。

2、迄今为止,采用多种传统方法制备的ASF灭活疫苗均不能对强毒攻击提供有效的免疫保护;

m 蛋白最为保守,由 orf6 编码, m 蛋白具有很强的免疫原性,感染后 10 d
即可激发产生可检测的抗体应答。

PRRSV 为不分节段的单股正链RNA 病毒。基因组长约15
kb,基本结构为5′­帽子结构­非编码区­ORF1a­ORF1b­ORF­非编码区­poly­3′。其中帽子结构有助于维持病毒基因组的稳定,防止被核酸酶降解。5′端非编码区(non­coding
region,NCR)长约190
nt,高度保守,在两种血清型毒株中其同源性可达99%。病毒基因组相邻的编码框有部分重叠。ORF1
包括ORF1a 和ORF1b,长约12 kb,占基因组的80%,编码病毒依赖RNA 的RNA
聚合酶。编码框ORF2~ORF7 编码病毒结构蛋白,其中, ORF2~ORF6
编码与病毒膜有关的蛋白,ORF7编码病毒核衣壳蛋白。ORF7
终止密码子之后为3′非编码区,含有一个poly 尾。Conzelmann 等报道,LV
株3′非编码区为114 nt。Mardassi 等报道,3′非编码区为151 nt,其中欧洲株
3′端非编码区比美洲株少37 nt,二者同源性为59%,利用这种差异可进行PRRSV
的分子诊断和病毒分型。值得指出的是,在高致病性蓝耳病的病毒基因组中,非结构蛋白Nsp2基因的第1
447~1 449位和第1 597~1
698位的核苷酸发生了缺失,与我国2005年以前分离的PRRSV相比,Nsp2基因的同源性仅为69.8%~86.2%[3]。

ASF亚单位疫苗的研究策略主要是将具有中和表位的非洲猪瘟病毒保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达,并将产生的蛋白质或多肽递呈给抗原递呈细胞,以诱导产生高滴度的抗非洲猪瘟病毒的中和抗体。

prrs活载体疫苗的研究是 prrs
基因工程疫苗的研究热点之一。带有目的基因的载体病毒在机体内复制的过程中使外源基因不断地表达,从而刺激机体产生针对其的免疫应答。载体病毒主要有杆状病毒、痘病毒、腺病毒、传染性胃肠炎病毒、伪狂犬病毒、大肠杆菌等。

Dobbe
等利用EAV感染性克隆,将GP5和膜蛋白M的胞外域编码序列,替换为其他相应的相关或非相关RNA病毒的对应序列。通过免疫荧光显微镜能观察到GP5和M蛋白复合体被运送到高尔基体,这有赖于它们之间形成的异二聚体,这一过程是病毒装配的前提条件。在所有嵌合病毒中,只有含PRRSV
或LDV 胞外域的嵌合病毒被致弱了,但还能存活,且依然能感染BHK­21
细胞和兔肾(RK­13)细胞,而PRRSV和LDV却不能感染这些细胞。这说明GP5
的胞外域并不像以前猜测的那样参与受体识别,也不是EAV细胞嗜性的主要决定因素。Wang
Y
等[20]将疫苗毒MLV和强毒株MN184的5′UTR/ORF1进行互换,分别构建了pMLVORF1/MN184和pMN184ORF1/MLV
感染性克隆,体外转录分别得到嵌合病毒rMLV和rMN184,本动物试验表明,MLV的5′UTR/ORF1
及ORF2­7/3′UTR可用于强毒致弱,为PRRSV疫苗的研究奠定了基础。

研究表明,一些ASFV毒株在缺失某些毒力基因或免疫抑制基因后,缺失毒株接种宿主毒力减弱且可诱导产生针对同源母本毒株或异源毒株的特异性免疫保护。例如,多基因家族360和530里面的基因,胸苷激酶基因和B119L或9GL基因,这些基因删除后可以降低病毒的毒力;例如,编码A238L蛋白、CD2v
蛋白、C-型凝集素和细胞凋亡抑制因子的基因被删除后可能会对猪产生适当的保护反应。

二。蓝耳病毒的研究进展

4.1 研究基因功能

虽然根据一个或两个ASFV抗原构建的DNA疫苗并不能诱导产生高水平的免疫保护效果,但是通过表达文库构建的4029个表达质粒进行的免疫攻毒保护试验结果来看,保护率达到60%,且免疫攻毒后存活的猪无排毒现象,这标志了核酸疫苗迈出的一大步。

三。目前蓝耳病防控面临的问题与挑战

2 病毒基因组结构及编码蛋白

灭活疫苗作为最经典的疫苗研制方式,在非洲猪瘟发现之后即已开始研发,但早期落后的灭活工艺无法取得满意的制苗效果。例如经加热,复方碘溶液,甲苯,福尔马林,结晶紫,β-丙内酯,乙酰氮丙啶和缩水甘油醛处理的ASF灭活疫苗虽部分能刺激猪产生抗体但即使借助佐剂仍无法抵御ASFV的攻击。感染猪的脾组织加上佐剂制作的疫苗保护范围有限且保护率也只有70%,攻毒后存活下来的猪也都表现临床症状。

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Lowe J F
等[7]用含编码ORF5的质粒进行DNA免疫,可使接种猪产生抗ORF5的特异性中和抗体,接种猪免于强毒攻击造成的全身性病毒血症和肺部病变,并使间质性肺炎和支气管肺泡炎明显减轻。Xue
Q等[8]用编码PRRSV
ORF5、ORF7和编码猪细胞因子IL­2、IFN­γ的真核表达质粒联合接种仔猪,诱导出高水平的体液免疫和细胞免疫反应,免疫猪能抵抗PRRS强毒的攻击。另外,Fang
L
等[9]将T细胞表位插入ORF5构建DNA疫苗免疫小鼠,检测到抗GP5抗体和T细胞的增殖,提高了GP5的免疫原性。江云波等[10]分别以PRRSV
ORF5m(修饰型ORF5 基因)及ORF6
为候选基因,分别构建了单基因及双基因共表达的真核表达质粒pCI­0RF5m、pCI­ORF6
及pCI­0RF5m/ORF6。将构建的表达质粒免疫小鼠,接种后6周试验组小鼠出现血清中和抗体,8
周时最高可达到1∶32,同时还可检测到特异性细胞免疫应答,pCI­0RF5m/ORF6的免疫效果明显高于单独表达ORF5m
基因的pCI­ORF5m 组。进一步将DNA疫苗免疫断奶仔猪,pCI­0RF5m/ORF6
免疫组同样能诱发优于pCI­0RF5m
免疫组的中和抗体和细胞免疫反应。结果表明,采用ORF5m 和ORF6
双基因共表达策略能够显著提高PRRSV DNA 疫苗效力。

文章摘要:9月26日的国务院常务会议,会上关于部分地方非洲猪瘟疫情、防控工作和下一步强化措施提出要求。会议指出,要开展综合防治、疫苗研发等关键技术攻关。那么,当前非洲猪瘟疫苗的研究进展如何呢?

利用先进的分子生物学技术开发新型疫苗

ORF4编码GP4,其分子质量大约为19 ku~20
ku,能诱导产生中和抗体。是组成病毒粒子的次要囊膜蛋白,通过共价键与GP3和GP2形成异源三聚体,并以异源多聚体的形式组装进PRRSV颗粒,它们对形成感染性病毒颗粒是必要的,不表达GP2,
GP3或GP4蛋白的基因敲除载体仍然能够组装成病毒粒子,但不具感染性[5]。

以OURT88/3免疫并用致弱性OURT88/1毒株进行加强免疫后,可以增加I
型干扰素的产生和增强干扰素的反应强度,可诱导机体产生针对ASFV
I型不同分离毒株的交叉保护,但是可造成诸多副反应。

1987年,首次暴发于美国爱荷华州,导致85000头猪死亡。“神秘病”,主要造成母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状。

4 PRRSV的反向遗传学研究

2、通过基因重组、靶向缺失以及一次性侵染技术来增强弱毒活疫苗的安全性。

prrsv 能干扰抗原的正确递呈和 t 淋巴细胞的活化,下调
mhcⅰ分子在树突状细胞中的表达

ORF5编码的糖基化囊膜蛋白GP5,又称E蛋白,含有4
个糖基化位点。分子质量为22.4
ku,有6个抗原决定簇,是诱导产生中和抗体的主要结构蛋白,病毒中和作用与抗GP5抗体效价呈显著相关性;GP5还可诱导细胞凋亡。GP5是PRRSV结构蛋白中变异最大的蛋白,同型毒株GP5氨基酸的同源性在88%~99%之间。而欧、美型毒株GP5氨基酸的同源性仅在52%~55%之间。loemba
H D等研究表明,E蛋白抗体比其他蛋白抗体产生得早,接种后7 d即可检测到。

所以传代致弱的ASFV安全性较差同时也不能提供有效的免疫保护。

亚单位疫苗研究主要针对 gp5 和 m 蛋白。将含有 prrv
保护性抗原基因的片段通过原核或真核表达方式,高效表达这些蛋白,配以相应的免疫佐剂制成亚单位疫苗。

4.3 在研究新型疫苗上的应用

3、自家灭活疫苗也无效;

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近年正在研制的PRRS的新型疫苗主要有基因疫苗和活载体疫苗。由于GP5含有病毒的中和位点,因此大多数PRRS新型疫苗都是以GP5为靶抗原研制的。

1、弱毒活疫苗能够诱导强烈持久的免疫应答,但生物安全是其使用的主要限制因素;

2、 prrs 活疫苗存在毒力返强的现象

ORF7编码核衣壳蛋白又称N蛋白,分子质量约为15
ku。N蛋白至少有5个抗原决定簇,其中包括两型的共同决定簇和特异性决定簇,具有一个糖基化位点,但它不是糖基化蛋白。N蛋白的C端在维持蛋白构象上起重要作用。其N端半段是由Arg、Lys和His
3种碱性氨基酸组成,这是两种血清型毒株所共有的特点,它们可能和RNA基因组间的相互作用有关。蛋白之间以二硫键形成同源二聚体。N蛋白的保守性较好,在病毒粒子中含量可达20%~40%,免疫原性强。感染PRRSV后约10
d可产生该蛋白抗体,产生的抗体无中和活性。通过对其抗体的检测可进行诊断,基于重组N蛋白的ELISA已应用到PRRS诊断与流行病学调查中[6]。

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染引起家猪、疣猪、欧洲野猪和美洲野猪的一种传染性极强的出血性疾病。所有年龄的猪都易感。世界动物卫生组织将其列为法定报告的动物疫病,我国将其列为一类动物疫病。

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GP3由ORF3编码,其分子质量约为45
ku,含有265个氨基酸,有7个N­糖基化位点,但是否为病毒的结构蛋白还有争议。GP3是PRRSV各毒株间保守性较差的蛋白之一,美洲型与欧洲型ORF3编码的氨基酸同源性低于55%,其功能可能与诱导细胞免疫有关。

核酸疫苗也就是DNA疫苗,是指将编码某种抗原蛋白的重组真核表达载体直接注射到动物体内,使外源基因在宿主细胞的表达系统内合成抗原蛋白,诱导宿主产生针对该抗原蛋白的特异性的体液免疫和细胞免疫应答,以达到预防和治疗疫病的目的。

m、gp3,gp4,和gp5蛋白都能诱导高浓度的中和抗体产生,gp5诱导的中和抗体最具有保护作用,所有prrs抗体中,抗n蛋白的抗体最多,但无中和活性。

2.1 病毒的基因结构

由于ASFV的抗感染机制十分复杂、基因型多且病毒容易变异,故ASF疫苗一直未研究成功,但国外科学家一直在不断尝试。

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Verheije M
H等[18]借助PRRSV感染性cDNA克隆,以研究病毒基因组的结构蛋白编码区是否存在病毒复制所必需的结构。通过缺失分析,证实编码核衣壳蛋白的ORF7中的34个核苷酸(14
653至14
686)是RNA复制所必需的,这34个核苷酸在所有的PRRSV分离株中高度保守,推测它能形成发夹结构。该发夹结构的弯曲部分的7个核苷酸,可能与PRRSV
3′端的非编码区内发夹结构的弯曲部分完全匹配,形成了紧密的互作。突变分析证实这一紧密互作是病毒RNA复制所必需的。孙志等[19]在构建北美株PRRSV感染性克隆pCBC2的基础上,将3′UTR中的一级结构进行了系列缺失或插入突变,并改变二级结构中的一个保守的茎环结构,构建全长PRRSV
突变体克隆,结果表明PRRSV
3′UTR的5′端可耐受41个核苷酸的缺失与23个核苷酸插入,但进一步缺失9个核苷酸则造成保守的环结构突变,病毒失去了感染性。证明了这是3′UTR
中控制PRRSV
复制过程的必需序列及二级结构,为进一步研究病毒复制调控元件奠定了基础。

Krug等人利用分离株ASFV-G在Vero细胞中进行传代至第110代完全丧失毒力,接种家猪后又不能获得相应的保护力。

核酸疫苗是利用基因工程技术将编码病原保护性蛋白的基因导入宿主细胞内,利用宿主细胞的转录系统合成病原保护性抗原,进而刺激机体产生免疫应答抵抗病原的感染。

3.1 基因疫苗

Lokhandwala等人将ASFV
p32、p54等基因分别重组入人腺病毒Ad5载体中,能够获得良好的抗原特异性反应。

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4.2 构建嵌合病毒研究基因变异与毒力之间的关系

P72,P30和P54是感染过程中引起体液免疫应答最重要的3个抗原蛋白。针对P30的抗体可以阻止病毒内吞,针对P72和P54的抗体可以阻止病毒吸附,但是将这三个蛋白制备疫苗具有一定的局限性。有研究表明,用p30和p54蛋白制备的疫苗仅能提供50%的保护,P54/30重组蛋白不能提供免疫保护,仅能延缓临床症状的出现时间和降低病毒血症水平。而多项试验都表明了单纯的将蛋白作为疫苗使用有多方面的不足。

1995年在中国大陆开始流行暴发

4.4 发展病毒载体的研究

也有学者将ASFV保护性抗原重组入腺病毒或痘病毒载体,以期获得更好的细胞免疫反应。但上述研究仍需通过攻毒保护试验来验证病毒活载体疫苗在使用中是否具有可行性。

3、prrsv的免疫学研究进展

摘 要:猪繁殖与呼吸综合征病毒 是严重危害养猪” target=”_blank”
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越来越多的科学家认识到细胞免疫在抵抗ASFV的感染过程中起到至关重要的作用。但是由于灭活疫苗本身的原因,很难刺激机体产生高水平的细胞免疫,尽管使用了目前为止效果最好的佐剂,对于刺激机体产生细胞免疫反应的程度也是非常有限,完全达不到有效的保护效果。

蓝耳病毒株多样性的问题

2.2 结构蛋白

4、细胞免疫在ASF疫苗免疫保护中起重要作用。

prrsv 感染猪体 4~12 周后,t 细胞开始增殖,同时表达 ifn-γ和 il-2。

Qiu H J等[11]以PRVBartha­K61
株为载体,构建表达PRRSV主要免疫原性蛋白GP5的重组伪狂犬病病毒疫苗,免疫仔猪后可以对PRRSV强毒攻击产生有效保护。Gagnon
C A等[12]用复制缺陷型人5型腺病毒(replication­defective
adenovirus,rAd)载体表达GP5
基因免疫猪后再攻毒,免疫猪产生了针对PRRSV的免疫记忆反应。Alonso S
等[13]利用传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis
virus,TGEV)辅助表达系统,构建了表达PRRSV
ORF5的质粒M39­ORF5,将M39­ORF5与TGEV辅助病毒一起免疫7日龄仔猪,采用滴鼻、口服和胃肠道三种途径联合免疫,共免疫3次,间隔7
d,在第3次免疫后7
d采血,采用GP5多肽检测抗体,免疫猪产生了很高的ELISA抗体,但该试验未检测中和抗体。Bastos
R G 等[14]用卡介苗表达缺失GP5 N端30
个氨基酸的重组体及M蛋白重组体免疫猪,接种30
d后,重组卡介苗免疫组产生了特异性的体液免疫反应,接种60
d后检测到中和抗体,接种67
d后可检测到抗卡介苗抗原的IFN­γ反应,攻毒试验表明,免疫猪可得到部分保护。Jiang
W 等[15]用
rAd­GP5、rAd­M和rAd­M­GP5分别免疫小鼠,结果显示表达的M­GP5融合蛋白对研制PRRSV疫苗最有潜力。Shen
G 等[16]以禽痘病毒(Fowlpox
virus)为载体分别得到了能表达ORF5­ORF3和IL­18­ORF5­ORF3的活载体rFPV­ORF5­ORF3
和rFPV­IL­18­ORF5­ORF3,对猪初免后21 d加强免疫,60
d后进行攻毒,免疫组的病毒血症和支气管淋巴结的病毒含量均低于对照组,免疫猪可得到部分保护。

小结:随着ASFV基因组及保护性抗原的不断深入研究以及表达载体的不断改造优化,DNA疫苗一定会在未来ASF疫苗市场上占据一席之地。

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Verheije M H 等[21]为获得PRRSV
减毒活疫苗,利用LV株的感染性cDNA克隆,在病毒基因组3′端引入了一系列的缺失。将这些缺失后的全长克隆体外转录后转染BHK­21细胞,细胞培养上清再接种PPAM以检测是否有病毒增殖。结果发现ORF7
编码的核衣壳蛋白C端最多可缺失6个氨基酸而不影响感染性病毒的产生。更进一步的缺失则既不能产生病毒,也得不到包含病毒RNA的病毒样颗粒。3′
UTR区紧邻ORF7
区域的缺失分析表明,去除ORF7终止密码子后面的7个核苷酸后,依然能得到感染性的病毒。缺失这一区域的32个核苷酸则完全终止了RNA的复制,从而阻止了感染性病毒的形成。将缺失突变体在PPAM上传代,证实了突变位点的遗传稳定性。此外,这些缺失并未影响重组病毒的体外生长特性,它们的抗原性与野生型病毒相似。缺失N蛋白6个残基突变体的免疫沉淀分析证实截短的蛋白确实较野生型N
蛋白更小。该研究所得到的缺失突变体是很有意义的PRRSV候选疫苗株。

蓝耳病对加拿大猪群生产力的影响42000 sows /205个猪场。

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5 PRRSV的分子生物学诊断

一、蓝耳病历史回顾及现状

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory
syndrome,PRRS)俗称猪蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种以母猪繁殖障碍、仔猪呼吸道症状和高病死率为特征的传染病。自1987年首次在美国发现以来,相继在各国呈流行性感染,给世界养猪业造成了严重的经济损失,被世界动物卫生组织列为必须报告的动物疫病,我国将其列为二类动物疫病。1991年Wensvoort等首次分离到该病毒,在第10次国际病毒大会上将该病毒归属于新设立的动脉炎病毒科、动脉炎病毒属。根据PRRSV基因组成和结构蛋白抗原特性的明显差异,又将PRRSV分为以LV株为代表的欧洲型和以ATCC
VR­2332株为代表的美洲型。两个毒株间氨基酸的同源性为78%~81%。1996年,郭宝清等首次报道从流产胎儿中分离到PRRSV,证实我国也存在猪繁殖与呼吸综合征。2006年以来,我国又暴发了以变异美洲型的高致病性蓝耳病,给我国养猪业造成了巨大的经济损失[1­2]。近年来,越南、老过、缅甸等周边国家也相继暴发PRRS。

prrsv免疫逃避机理,迟发性中和抗体?

Verheije M H
等[22]通过在LV株感染性cDNA克隆中插入外源抗原编码序列,首次验证了PRRSV
作为病毒载体的可能性。将人A型流感病毒血凝素蛋白的一个表位引入LV
的5′端和3′端,分别得到了HA表位和N
蛋白的融合蛋白。此外,5′端含HA表位的重组子,还在HA和ORF7之间另加了一个口蹄疫病毒自剪切蛋白酶2A的编码区,并使它们处于同一读码框内,以确保从杂合的前体中产生有功能的N蛋白。当全长cDNA克隆体外转录出的RNA转染BHK­21细胞后,两个重组子都能复制,能表达HA表位,并能产生子代病毒。然而,将HA
表位直接融合到N蛋白的N端或C端,都影响了重组病毒的存活及其遗传稳定性。重组病毒在PPAM上传代,证实部分病毒在第4代丢失了HA表位。相比之下,以前体切割形式表达HA表位的重组病毒,在第4代时HA表位依然存在。这些病毒的生存都未受到影响。免疫沉淀和脉冲示踪试验表明,2A蛋白酶将HA表位从N蛋白中共转录切割。他们的结果证实了利用PRRSV
作为病毒载体的可行性,即PRRSV也能将其他病原体的抗原传递给猪的免疫系统。

prrs特异性体液免疫反应

GP2由ORF2编码,分子质量约为30
ku。GP2为糖蛋白,有两个明显的疏水峰和糖基化位点,肽链内含有二硫键,通过二硫键和其他结构蛋白可形成同源或异源多聚体,其糖基化位点覆盖有N­聚糖复合物。GP2蛋白表面有一个抗原位点,其周围有一个与GP5蛋白B细胞抗原位点构成一级结构的VSRRIYQ基元。GP2蛋白免疫原性差,在病毒中含量较少,很难从感染的细胞裂解液或纯化的病毒粒子中进行分离鉴定[4]。

2006年,全国暴发,据统计6-9月份,我国共有200万头生猪发病,死亡40余万。

PRRSV为有囊膜的单股正链RNA病毒,病毒粒子直径45 nm~65 nm,核衣壳25
nm~35 nm,表面有明显的长约5
nm的纤突,核衣壳呈立体对称的20面体。PRRSV对温度和湿度较敏感,潮湿环境有利于PRRSV的存活,在低温下可长期存活,但在干燥条件下病毒的感染性迅速失活。PRRSV对pH变化敏感,在pH
6.5~7.5间相对稳定,超出这个范围其感染力可下降90%以上。PRRSV不具有凝集红细胞特性,但经非离子除垢剂和脂溶剂处理后可凝集小鼠红细胞。病毒在蔗糖和氯化铯中的浮密度分别为1.13
g/cm3~1.19 g/cm3和1.18 g/cm3~1.23 g/cm3
。在猪体内,病毒对单核巨噬细胞系统有嗜性,尤其是猪肺泡巨噬细胞;在体外,病毒可在Marc­145、MA­104和CL2621等多种传代细胞系上繁殖,产生的细胞病变一般不明显,但高致病性蓝耳病毒株在Marc­145细胞中适应1代~3代即可产生明显的细胞病变。PRRSV具有抗体依赖性增强作用(antibody
dependent
enhancement,ADE),当病毒和抗体结合产生抗原抗体复合物后,借助Ab的Fc片段与靶细胞的Fc受体结合,从而促进病毒进入细胞。因此在细胞培养物中加入一定滴度的PRRSV抗体,可显著提高病毒的含量。PRRSV可通过胎盘感染胎儿,造成流产和木乃伊胎。另外,PRRSV在猪体内可造成持续感染。

2.蓝耳病病毒的遗传变异

3.2 活载体疫苗

prrsv
感染后可以产生强而快速的体液免疫反应,但是,前期产生的抗体却不能提供保护甚至是有害的,因为有些抗体可以引发抗体依赖性增强作用,介导并促进病毒对细胞的感染。猪感染
prrsv
后出生的体液免疫和细胞免疫是迟发性的,ifn-γ的分泌也是不规则的,而要获得完全的保护需要一定滴度的中和抗体和一定浓度的
ifn-γ。

park 等证实在母猪怀孕 90 d 时染毒,低毒力和高毒力的 prrsv
穿过胎盘屏障的能力相同,也就是说 prrsv
对胎盘屏障的穿透能力与病毒毒力无关。发现怀孕母猪接种 prrs
弱毒疫苗,疫苗病毒可通过胎盘引起胎儿病毒血症从而导致先天性感染,且感染猪出生后还能传染同窝非免疫仔猪。

一。蓝耳病历史回顾及现状

prrsv
主要侵害猪体的单核细胞-巨噬细胞系统,尤其是肺泡巨噬细胞,导致感染肺泡巨噬细胞在短时间损失殆尽,造成免疫系统紊乱,导致免疫力降低,甚至免疫抑制,继发感染增多,引发多系统、多器官疾病,如间质性肺炎、坏死性淋巴结炎、脑炎等。

gp5、m 蛋白和 n 蛋白是构成 prrsv 粒子的 3 种主要结构蛋白,gp5 蛋白由
orf5 编码,分子量为 24.5~26 ku,是 3
个蛋白中唯一的糖蛋白,也是最主要的保护性抗原蛋白

中国控制猪蓝耳病的未来方向

由于 prrsv 是有囊膜的 rna 病毒,基因组存在高度的变异性,在 prrsv
粒子中,最为保守的蛋白为 m 蛋白,其次是 n 蛋白,变异最为显着的是
nsp2、gp3 和 gp5。prrsv 变异主要通过随机的基因缺失和基因内重组来实现的。

prrsv感染与特异性细胞免疫

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四。未来的展望及对策

一。蓝耳病历史回顾及现状 二。蓝耳病毒的研究进展
三。目前蓝耳病防控面临的问题与挑战 四。未来的展望及对策
一、蓝耳病历史回顾及现状…

三、目前蓝耳病防控面临的问题与挑战

prrsv 感染的显着特点是诱发迟发性的中和抗体。欧洲株和美洲株的主要中和表位
b 位。但在 gp5 的 n 端有一个类似于人免疫缺陷病毒ⅰ型的诱表位(ostrowski
et al., 2002),它可以干扰主要表位 b 的免疫反应,造成中和抗体延迟产生。

二、蓝耳病毒的研究进展

n蛋白抗体可在感染后5d检测到,但无中和活性,中和抗体要到21天出现。

四、未来的展望及对策